刘亚磊，贾新林，陈思润，徐盛玉
（四川农业大学动物营养研究所，四川成都 611130）
我国农业农村部规定2020 年7 月1 日起饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料。饲料端禁止抗生素使用对我国养殖业和饲料行业来说都是一个挑战，随着动物的抵抗能力降低，发病率增高，治疗性抗生素用量的增加会使养殖业面临巨大压力。近年来，人们不断寻找抗生素替代品。金属离子抗菌产品具有性价比高、质量稳定、广谱抗菌性、不易产生耐药性等优势。镓（Gallium，Ga）离子已被美国食品药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准应用于医药领域。镓离子不仅对肿瘤治疗有积极作用，且具有抗菌活性，此外还具有抗炎、免疫调节、抗高钙和镇痛的作用，因此各种镓制剂越来越多地用于抗菌和临床的研究。目前已知镓离子的抗菌作用主要与细菌铁代谢有关，但是镓离子抗菌作用的具体机制和分子靶点并不明确。目前养殖业面临严峻挑战，而镓离子有显著的抗菌活性，探究镓离子能否作为替抗产品应用于动物生产具有重要意义。本文综述了镓离子的抗菌作用及机制研究进展，为镓离子抗菌剂作为替抗产品应用于动物生产提供参考。
1 镓及其生理功能1875 年，法国化学家布瓦博得朗（Paul Emile Lecoq de Boisbaudran）首次发现了镓元素，其原子序数为31，原子量为69.723，位于第四周期第IIIA 族。镓是第一个先由理论预测而后在自然界中被发现证实的化学元素，动物必需的微量元素中并没有镓，也没有发现镓有生理功能。Dudley 等对大鼠注射乳酸镓（Gallium Lactate），发现镓可被肠道微量地吸收，然后进入到骨、肝脏和肾脏中，镓主要通过尿液排出体外。低剂量注射乳酸镓并不会对机体产生毒害作用，目前并没有文献表明镓有生殖毒性。
镓化合物作为抗癌药物很早就被应用到临床研究，随着新型镓制剂的研发，其抗癌效果也更加显著。硝酸镓（Gallium Nitrate）是多发性骨髓瘤、骨质疏松症的有效治疗药物；镓还可以通过影响T 细胞和巨噬细胞发挥抗炎和免疫调节作用，也可通过影响破骨细胞和成骨细胞发挥抗高钙血的作用。另外，镓可参与细菌铁代谢而具有抗菌活性。
微生物的生存和生长需要铁，铁可参与蛋白质合成、DNA 合成、三羧酸循环、氧化应激反应、电子传递等重要的生物学过程。而镓之所以能够对细菌的铁代谢产生影响，主要是因为镓与铁的化学性质有相似性。镓和铁的八面体离子半径分别为0.620、0.645 Å，四面体离子半径分别为0.47、0.49 Å，电子亲和值分别为30.71、30.65 eV。细菌生物系统不能区分镓和铁，因此镓可以有效地被细菌所摄取，并参与细菌的生化过程。Fe还原为Fe是许多细胞代谢过程中的关键步骤，与铁不同的是，镓在生理条件下不能被还原，因此，镓能破坏细菌氧化还原过程，抑制其基本功能，最后达到杀菌效果。
2 镓离子的抗菌作用2.1 镓离子体外抗菌作用 2000 年以前关于镓抗菌的研究并未取得明显的进展，随着镓离子的作用得到重视，人们对镓离子的抗菌效果做了更广泛深入的研究，发现很多镓化合物具有良好的抗菌活性。对镓化合物体外抗菌的研究发现其对一种或几种致病菌具有抑制作用。本文对近几年有关镓化合物体外抗菌的一些最新成果进行总结，包括镓化合物在不同生长培养基条件下对不同细菌的抑制浓度、对寄生虫的抑制浓度（表1）以及人工合成的镓离子材料的抑菌作用（表2）。
表1 镓化合物对不同细菌的体外抑制浓度
表2 镓离子材料抑菌作用
以上研究表明，很多镓化合物在体外对病原虫及多种细菌有良好的抑制作用，并且培养基不同其抑制效果也有所不同，特别是培养基中铁含量显著影响镓的抑制浓度，因此镓发挥抗菌作用与细菌铁代谢有关。另外，很多人工合成的镓离子材料也对细菌具有良好的杀灭效果，说明镓离子在体外的抗菌效果非常显著。
2.2 镓离子体内抗菌作用 镓不仅在体外具有良好的抗菌效果，在动物体内同样具有抗菌效果（表3）。在一些感染了细菌的动物模型中，镓很好地发挥了抗菌作用。研究发现，对肺部感染了铜绿假单胞菌的小鼠和人注射硝酸镓，小鼠存活率提高，肺和血液中铜绿假单胞菌数量减少，对人体也有积极的治疗作用。Lawless 等研究发现将镓涂抹于马远端肢体创伤面上可减少愈合时间，并减少生物负载和旺盛肉芽组织，同时降低了创伤面细菌数量。大蜡螟幼虫感染铜绿假单胞菌后注射镓可提高其存活率，增加血细胞的产生，显著提高了抗菌活性。镓也可通过抑制金黄色葡萄球菌并在短期内诱导纤维组织生长，从而对大鼠骨髓炎有治疗效果。在兔雅司病模型中，外用麦芽酸镓可显著抑制皮损发展，降低接种部位梅毒螺旋体。纳米镓可穿透秀丽隐杆线虫杀死铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，从而延长秀丽隐杆线虫的存活时间，并且纳米镓对幼虫并没有明显的负面影响。在大鼠创面植入载镓真皮支架对铜绿假单胞菌有明显的预防作用，且具有良好的生物相容性。
表3 镓化合物在动物体内的抗菌作用
以上研究表明，很多镓化合物对感染细菌的动物模型具有良好的治疗效果，说明镓离子在体内的抗菌效果同样显著。但是不同研究使用的镓化合物剂量有很大差异，而且几乎全是注射或外用镓，说明镓的使用还没有明确的剂量，注射或外用的方式可能更有利于镓发挥作用。值得注意的是，目前镓在畜禽上的应用较少，可能原因是镓并没有被人们所熟知，镓作为比稀土还要稀缺的战略金属成本较高，另外考虑到镓的安全性以及排放等问题，因此镓没有得到广泛应用。尽管如此，镓离子的优势依然明显，在畜禽上合理使用镓具有广阔前景。
2.3 其他 一些最新的研究表明，镓不仅对细菌有抑制作用，而且对真菌也有较好的抑制作用。通过分析抑菌圈直径，有研究发现镓叶酸配合物（）除了对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等细菌有杀灭作用，对黄曲霉（）和白色念珠菌（）等真菌同样具有杀灭作用。硝酸镓对烟曲霉菌（）有抑制作用，MIC=32 mg/L；对不同种类的念珠菌也有抑制作用，MIC=16～256 mg/L。一些镓基材料如镓基生物活性玻璃及其高分子水凝胶复合材料均对白色念珠菌有良好的抑制效果。
以上研究表明，镓对细菌、真菌、病原虫均有抑制作用，因此镓作为抗菌药物应用于动物生产以及临床具有很大的潜力。
3 镓离子的抗菌机制镓离子发挥抗菌作用主要是由于其干扰细菌的铁代谢，对细菌产生不利影响。铁是细菌生长必需的营养物质，在宿主体内，铁主要与转铁蛋白（Transferrin）、乳铁蛋白（Lactoferrin）或血红素（Heme）结合，游离的铁离子非常少，这些蛋白质为入侵的细菌创造了一个限铁环境，使细菌难以获得铁，从而抑制细菌生长。然而细菌也进化出几种铁转运系统来满足自身需要，而镓离子正是通过参与细菌的铁转运系统，进一步影响细菌的正常生长代谢，如使细菌铁依赖酶失活、产生氧化应激，从而起到杀菌作用。
3.1 镓参与细菌铁转运系统使细菌铁缺乏 细菌可通过铁载体（Siderophores）转运系统、血红素转运系统、转铁蛋白和乳铁蛋白转运系统来获取铁，由于细菌不能有效地区分镓和铁，因此镓离子便可以参与上述3 种铁转运系统，从而顺利被细菌所摄取进入细菌细胞内，导致细菌铁缺乏。其参与过程主要是通过一些受体蛋白以及在转运体提供能量的条件下进行（图1）。
3.1.1 镓可与细菌铁载体结合 铁载体是细菌合成和分泌的一种小分子有机物，作为一种铁螯合剂可以强力结合Fe，对细菌的生长起着至关重要的作用。铁载体能够和宿主体内的转铁蛋白、乳铁蛋白等铁结合蛋白竞争Fe，从而形成Fe-铁载体复合物，这种复合物与细菌细胞外膜上的铁载体受体蛋白（Outer-Membrane Receptors，OMRs）相结合，然后通过TonB 系统被细菌摄取进入细胞内（图1），Fe进入细胞质后被还原为Fe，Fe与铁载体的亲和力低，从而被释放。分子建模研究表明，镓可与铁载体紧密结合，并且镓与铁载体结合的能力甚至优于铁，因此镓与铁载体结合降低了未结合金属离子的铁载体浓度，抑制了细菌铁摄取。另外，镓与铁载体有很高的亲和力，有利于细菌受体的识别，从而避开细菌的防御系统，以镓-铁载体复合物的形式被细菌所摄取，由于镓离子并不能被还原，因此可扰乱细菌的代谢。此外也可以直接设计镓铁载体复合物，可以更高效地针对细菌铁载体转运系统对细菌产生抑制，研究发现，人工合成的镓铁载体复合物其对结核分歧杆菌（s）的抗菌效果比硝酸镓提高了1 倍。
图1 细菌铁转运系统及镓参与细菌铁转运系统
3.1.2 镓可与转铁蛋白和乳铁蛋白结合 转铁蛋白是血浆中主要的含铁蛋白质，动物体消化吸收的铁和红细胞降解释放的铁都是由转铁蛋白运载。乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族，同样参与铁的转运。细菌可以通过转铁蛋白结合蛋白（Transferrin Binding Proteins，TBPs）或乳铁蛋白结合蛋白（Lactoferrin Binding Proteins，LBPs）来获取宿主转铁蛋白或乳铁蛋白中的铁，整个摄取系统由TonB 系统提供能量（图1）。Nikoleta 等采用分子建模工具探索镓在原子水平上的抗菌机制，结果表明，虽然转铁蛋白对镓有很高的亲和力，但是转铁蛋白优先与铁结合，并且镓不能置换出转铁蛋白中的铁。值得注意的是，镓和铁在与转铁蛋白结合位点的竞争中，镓虽然不能胜过铁，但是转铁蛋白只有1/3 的结合位点被铁占据，因此镓仍然可以与转铁蛋白结合。镓与转铁蛋白结合形成复合物后，被细菌TBPs 结合，然后转铁蛋白中的镓透过细胞质膜被运输到细胞内，镓便可以参与细菌的代谢，而且镓还可以抑制铁的释放。
3.1.3 镓化合物干扰细菌血红素转运系统 在宿主体内，大多数的铁离子以血红素的形式存在。血红素又称亚铁原卟啉（Ferroprotoporphyrin），是一种铁卟啉（Iron Porphyrin）化合物，参与血红蛋白和肌红蛋白的组成，每个血红素含一个亚铁离子。细菌拥有高效的血红素转运系统，通过外膜上的血红素受体与ABC 转运蛋白可将血红素或血红蛋白转运至细胞质中，然后被血红素氧化酶（heme oxygenase，HO）或血红素降解蛋白（hemedegrading protein）降解，从而获得铁离子（图1）。由于细菌高效的血红素获取系统，一些类似血红素的卟啉类化合物已经被用作抗菌剂。卟啉与铁以外的金属络合物可以干扰细菌的血红素获取系统，从而具有抗菌活性。由于镓具有与铁相似的化学特性，因此镓具有多方面的优势，如镓能够更好地与卟啉络合，络合物能更容易被细菌识别，从而被细菌所摄取干扰其代谢。镓与卟啉的络合物中最具代表性的便是原卟啉镓，具有良好的抗菌活性。
3.2 镓进入细菌细胞后诱导细菌死亡 镓离子进入细菌细胞后可降低铁依赖酶的活性，使DNA 合成降低；通过影响细胞色素破坏电子传递链；产生氧化应激，影响细菌正常形态，最终导致细菌的死亡（图2）。
图2 镓诱导细菌死亡的途径
3.2.1 镓使细菌铁依赖酶活性降低或失活 细菌的繁殖较快，代谢也很旺盛，因此细菌对铁的需求很高，相关的铁依赖酶的活力也很高，镓的代谢干扰对细菌的杀伤力也很高。镓干扰细菌摄取铁导致细菌铁缺乏，进一步使铁依赖酶的活性降低甚至失活，特别是核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide Reductase，RR）。在RR 催化下，核糖核苷酸（Ribotide）被还原为脱氧核糖核苷酸（Deoxynucleotide），RR 是DNA 合成和修复的关键酶和限速酶，因此对于细菌繁殖至关重要。在细菌缺铁的情况下，导致RR 的M2 亚基活性受到抑制，最终使RR 失活，DNA 的合成被阻止。分子建模研究发现，镓可以取代RR 金属结合位点上的铁，从而导致酶抑制，镓还可以与RR 的底物二磷酸核苷（nucleoside diphosphates，NDPs）结合形成复合物，而RR 不能识别这种复合物，从而降低了底物水平，导致RR 饥饿，DNA 合成被阻止（图2）。细菌摄取镓同样会影响其他的铁依赖酶，比如过氧化物酶（Peroxidase）、过氧化氢酶（Catalase）、含铁超氧化物歧化酶（Iron-Containing Superoxide Dismutase）、乌头酸酶（Aconitase）等，铁缺乏导致这些酶的活性被抑制，与这些酶有关的代谢反应也会被抑制。
3.2.2 镓可破坏细菌电子传递链 含铁硫簇（Iron-Sulfur Cluster）的蛋白质在三羧酸循环（Citric Acid Cycle）和电子传递链（Electron Transport Chain）中非常重要，而镓很可能与这些蛋白质相互作用，从而影响细菌的呼吸和能量代谢。细胞色素是一类以血红素作为辅基的电子传递蛋白，通过血红素辅基中铁原子的还原态（Fe）和氧化态（Fe）之间的可逆变化传递电子，参与细菌的氧化还原反应。原卟啉镓体外培养细菌结果表明，原卟啉镓很可能通过血红素转运系统与细胞色素结合，导致细胞色素不能传递电子，从而破坏细菌的电子传递链（图2）。
3.2.3 镓可使细菌产生氧化应激 镓可以诱导细菌细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的产生，使细菌产生氧化应激，致使DNA 氧化损伤，包括链断裂和核苷酸修饰，其中SOS 相关基因SulA 表达上调，其产物与细菌处于分裂状态时隔膜形成的关键蛋白FtsZ 结合，抑制FtsZ 蛋白组装，影响Z 环的形成，最后阻止细菌分裂（图2）。
3.3 其他 硝酸镓可以破坏细菌的细胞膜，阻止细胞膜生成，镓与庆大霉素（Gentamycin）联合使用可以完全消除铜绿假单胞菌被膜的形成。用硝酸镓处理的铜绿假单胞菌中与应激反应、DNA 损伤/ 修复、铁硫簇和血红素储存相关的蛋白丰度增加，而与群体感应、鞭毛运动和细胞氧化还原相关的蛋白丰度降低。镓可与铁竞争某些含铁蛋白质的金属结合位点，不同的培养基会对镓在体外的抗菌活性产生影响，而培养基中铁含量至关重要。限铁条件会增强镓的抗菌效果，而在培养基中添加铁会降低镓的抑菌作用，在感染细菌的动物模型中添加铁同样会降低镓的治疗效果。因此，镓的抗菌机制和铁紧密相关，在铁含量较少的情况下能发挥更大的作用。
4 展望体内和体外试验表明，镓类化合物具有明显的抗真菌、抗细菌活性。镓和铁具有相似性，可通过细菌的铁转运系统进入细菌细胞内，从而干扰细菌代谢，最终达到杀菌目的。但是镓的抗菌机制并未明确，因此镓的抗菌效果及机制的研究有待进一步深入。
目前以细菌营养和新陈代谢为目标的抗菌策略正受到越来越多的关注，镓具有明显的抗菌效果，镓离子抗菌剂是多靶点药物，所以，细菌不易对镓产生耐药性。此外合理剂量的镓对宿主并无毒害作用。目前养殖业都是集约化养殖，饲料端禁止抗生素使用后，猪的细菌性疾病发病率会增加，导致生产效率降低，由于镓在畜禽上的应用较少，因此镓对畜禽等动物的抗菌、免疫、调节作用及机制的研究有待开展及深入，从而在一定理论的指导下为镓在畜禽上的应用提供相应数据支撑。镓已在临床上用于癌症的治疗，未来其在动物生产上的应用具有广阔的前景。
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